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[转载]MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)(

作者:admin 来源:本站 发布时间: 2013-06-17 22:48  浏览次数:
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一:概述

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA,其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式,都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此,对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法,这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测,其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。


以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程:

二:背景资料

检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下:

  Primer ID Mature_Acc Mature_ID PCR_SIZE
1 hsmq-0031_01 MIMAT0000069 has-miR-16 75
2 hsmq-0032_01 MIMAT0000422 hsa-miR-124 73
3 hsmq-0033_01 MIMAT0000443 hsa-miR-125a-5p 77
4 hsmq-0034_01 MIMAT0000423 hsa-miR-125b 75
5 hsmq-0035_01 MIMAT0000429 hsa-miR-137 76
6 hsmq-0036_01 MIMAT0000250 hsa-miR-139-5p 75
7 hsmq-0037_01 MIMAT0000437 hsa-miR-145 76
8 hsmq-0038_01 MIMAT0000450 hsa-miR-149 76
9 hsmq-0039_01 MIMAT0000439 hsa-miR-153 75
10 hsmq-0040_01 MIMAT0000452 hsa-miR-154 75
11 hsmq-0041_01 MIMAT0000259 hsa-miR-182 77
12 hsmq-0042_01 MIMAT0000261 hsa-miR-183 75
13 hsmq-0043_01 MIMAT0000458 hsa-miR-190 75
14 hsmq-0044_01 MIMAT0000276 hsa-miR-219-5p 74
15 hsmq-0045_01 MIMAT0000077 hsa-miR-22 75
16 hsmq-0046_01 MIMAT0000082 hsa-miR-26a 75
17 hsmq-0047_01 MIMAT0000100 hsa-miR-29b 76
18 hsmq-0048_01 MIMAT0000244 hsa-miR-30c 76
19 hsmq-0049_01 MIMAT0000441 hsa-miR-9 76
20 hsmq-0050_01 MIMAT0000689 hsa-miR-99b 75
21 hsnRNA-U6_01 M14486 hsnRNA-U6 81

 

三:实验内容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。

四:实验主要仪器和试剂

主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要实验试剂:TRIzol(Invitrogen)、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。

五:实验操作

前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性,在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头,同时实验操作时,需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。

1、样品处理:取50mg~200mg样品直接在液氮中研磨至粉末,再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中,反复振荡裂解组织细胞。(Note:如为贴壁细胞,去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol),反复吹打裂解细胞,再收集TRIzol至离心管中;如为悬浮细胞,离心收集悬浮细胞,加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞)。

2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后,每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL,盖上盖子,剧烈振荡约1min,室温静置5min,然后12000g 冷冻离心15min(4℃),小心取出样品,通过观察可以发现样品分三层,其中最上层含有RNA样品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL(每1mLTRIzol 的吸取量)至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中,混匀,12000g 冷冻离心10min(4℃)。

4、RNA洗涤:去上清,加入500μL 冷冻的75%乙醇,弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min(4℃),去上清,再稍离,吸去上清液。

5、RNA溶解:风干约5~10min(注意不能风太干,只需要沉淀泛白即可),加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。

6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后,在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度,以DEPC水做空白对照,同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。Note:如为常规的分光光度计,注意比色杯测定时的最少所需体积量,取一定量的RNA,用DEPC水稀释约100倍左右,同时在紫外条件下测定OD260和OD280,再按照公式计算RNA浓度=40ng/μL×OD260×稀释倍数)。

7、RNA电泳检测:
7.1 变性胶制备:
取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸,冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上,盖上盖子。

7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops):取50mL10×Mops ,用去离子水稀释至500mL,倒入电泳槽中。

7.3 RNA样品处理:取RNA样品约3μL,最后补充DEPC水至15μL,65℃变性10min后立即冷却,加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。

7.4 RNA电泳:先把RNA胶放入电泳槽中,100V作用电泳约5min,再在点样孔中点入处理过的RNA样品,100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处,取胶拍照。

8、RNA抽提结果:
8.1. RNA电泳图(取3ul RNA 样品):

8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度OD 260/OD280。

RNA来源 RNA浓度(ng/ul ) OD 260/OD280
人脑组织 3470 1.9

9、miRNA 3’端进行加“Poly A”处理

  • 融解加“PolyA”反应所需的试剂,上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。
  • PolyA Reaction 反应液的配制

在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL

试剂组分 体积 终浓度
Total RNA 2μg
2.5U/μLPolyA Polymerase 1μL 2.5U
10×PolyA Polymerase Buffer 2μL
10×rATP Solution 2μL
ddH2O(RNase/DNase free) 补至20μL
在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng~10μg之间调整,如使用纯化的小分子RNA,其使用量可在10ng~1μg之间调整。

10、PolyA反应:

混匀配制的反应mix,短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验,也可以放置-20℃短暂保存,如需长期保存建议存放于-80℃。

11、Poly A化的RNA进行反转录反应:

融解反转录反应所需的试剂,上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反应:
在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL

试剂组分 体积 终浓度
PolyA反应液 2μL  
25×Oligo dT Adaptor 1μL
ddH2O(RNase/DNasfree) 10μL  
Final Volume 13μL  
混匀RNA-Primer Mix,短暂离心,直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。
配制反转录反应液:
在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。
试剂组分 体积 终浓度
RNA-Primer Mix 13μL
5×RT Reaction Buffer 5μL
25mM dNTP 1μL 1mM
25U/μL RNase Inhibitor 1μL 25U
200U/μL M-MLV RTase (RNase H free) 1μL 200U
ddH2O(RNase/DNase free) 4μL
Final Volume 25μL

反转录反应:
混匀配制的反应mix,短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。 所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。

12、qPCR 检测miRNA.

miRNA检测引物设计:miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物:“Universal adaptor PCR Primer”,Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18~24nt之间,所以其检测的 Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列:如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体,其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。

miRNA qPCR Forward Primer 设计举例(以小鼠mmu-miR-125b-5p为例):
在miRNA Database中查找检测的miRNA序列,如下图所示:
miRNA Database:
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL

则其Forward 检测引物可为:

miRNA sequence ucccugagacccuaacuuguga
Primer sequence tccctgagaccctaacttgtga (Tm:58.8)

融解2×qPCR mix(如有必要,融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。冰上进行qPCR反应液的配制(所有miRNA进行复孔测试,同时进行单孔NTC(No template control)测试)

试剂组分 体积 终浓度
2×qPCR Mix 10μL
qPCR Forward Primer(2μM) 2μL 0.2μM
Universal Adaptor PCR (2μM) 2μL 0.2μM
1st strand cDNA(diluted 1:5) 2μL
ddH2O 4μL
Final Volume 20μL
1)2×qPCR Mix设定为总反应体积的一半,其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积,请保持最适条件下各组分的比例。
2)Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪,如ABI的定量PCR仪。
3)引物终浓度可在0.2μM~0.4μM范围内调整,一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
4)1st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用 ,防止反转录体系对qPCR体系的影响。
5)充分混匀qPCR反应液,添加至PCR反应管中,短暂离心,确保所有试剂到反应管底部。
6)qPCR 反应,使用标准的三步法进行检测(以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计)。
循环数 步骤 温度 时间 检测
1 预变性 95℃ 10min
变性 95℃ 10sec
40 退火 57℃ 20sec
延伸 72℃ 10sec

对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析(以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计)

检测温度范围 升温速率 恒温时间 检测
70℃~95℃ 0.5℃/次 6 sec/次
30℃ 30sec
1)、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶,95℃ 10min能充分的激活酶活性。
2)、因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性,在检测时应严格控制退火温度,防止出现非特异性扩增。
3)、进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt,为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右(miRNA序列一般为22nt左右),所以延伸只需10sec即可。对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃~83℃范围内,如果超出此范围,建议使用别的方法来验证产物的特异性(如电泳)。

以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器,如使用的为不同公司的定量PCR仪,请按照不同的仪器要求,调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。

 

:结果分析

20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果

20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值

  Primer ID Mature_ID PCR_SIZE 组织 Sample Ave. Ct 胶泳道
1 hsmq-0031_01 has-miR-16 75 27.02 1
2 hsmq-0032_01 hsa-miR-124 73 22.98 2
3 hsmq-0033_01 hsa-miR-125a-5p 77 27.81 3
4 hsmq-0034_01 hsa-miR-125b 75 22.58 4
5 hsmq-0035_01 hsa-miR-137 76 28.51 5
6 hsmq-0036_01 hsa-miR-139-5p 75 30.66 6
7 hsmq-0037_01 hsa-miR-145 76 24.7 7
8 hsmq-0038_01 hsa-miR-149 76 29.71 8
9 hsmq-0039_01 hsa-miR-153 75 27.61 9
10 hsmq-0040_01 hsa-miR-154 75 30.39 10
11 hsmq-0041_01 hsa-miR-182 77 34.64 11
12 hsmq-0042_01 hsa-miR-183 75 33.86 12
13 hsmq-0043_01 hsa-miR-190 75 32.28 13
14 hsmq-0044_01 hsa-miR-219-5p 74 28.16 14
15 hsmq-0045_01 hsa-miR-22 75 24.09 15
16 hsmq-0046_01 hsa-miR-26a 75 22.66 16
17 hsmq-0047_01 hsa-miR-29b 76 26.72 17
18 hsmq-0048_01 hsa-miR-30c 76 26.54 18
19 hsmq-0049_01 hsa-miR-9 76 23.11 19
20 hsmq-0050_01 hsa-miR-99b 75 27.06 20
21 hsnRNA-U6_01 M14486 81 22.26 21

 

原文地址:MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)作者:

 

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