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多聚酶链式反应(PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

作者:www.bilong.com 来源:网络 发布时间: 2012-11-30 09:18  浏览次数:
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实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理,掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

实验原理

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:

PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1.变性:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。

2.退火:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。

3.延伸:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环,即高温变性低温退火中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

琼脂糖凝胶电泳的原理:琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察,可检测到5 ng以上的DNA。

实验材料及相关试剂

基因组DNA,基因特异性引物,PCR扩增相关试剂,等

四、实验步骤

1.模板DNA的抽提:实验一所得的水稻基因组DNA。

2.PCR操作 (在冰上操作):

(1)PCR反应混合液的配制:反应体系25 µL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样:

反应物 加样顺序 体积/µL 终浓度
ddH2O 1 17.3×n  
10 x Buffer 2 2.5×n 1 x
25 mmol/L MgCl2 3 1.5×n 1.5 mmol/L
10 mmol/L dNTP 4 0.5×n 200 µmol/L
10 µM上游引物 5 1×n 0.4 µmol/L
10 µM下游引物 6 1×n 0.4 µmol/L
DNA Taq聚合酶 7 0.2×n 1 U

(2)将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 µL反应混合液,再加1 µL模板DNA,最后加1滴石蜡油,防止水分蒸发, 然后稍离心。

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