引言 HIV抗体初筛实验最常见方法是酶联免疫吸附法（ELISA），实验中许多因素使结果产生不确定性，现作如下探讨。
1 一般资料 2001/2007入伍新兵26600名血清标本进行HIV抗体测定，常规抽取静脉血，低速离心分离血清，在2h内严格按照说明书完成测定。酶标仪为DENLEY DRAGON WE Scan MK2型自动酶标仪，洗板机为Stat fax-2600型洗板机，移液器为eppendorf电子可调移液器，试剂盒由北京金豪制药有限公司生产; 临界值设定为cutoff值=0.1+N（ 阴性对照平均值）。标本A值小于cutoff值为阴性，大于或等于cutoff值为阳性；阴性对照A值小于0.02时，按0.02计算；阳性对照A值小于0.5，阴性对照A值大于0.1，实验不成立。 结果全部标本HIV抗体阴性。标本溶血，加样快慢，孵育显色时间，采用单、双波长测定，洗涤液浓度等均对ELISA测定HIV抗体有较大影响。
2 讨论
2.1 标本采集与保存 ①避免溶血：血红蛋白含有血红素基团，有类似过氧化物作用，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的ELISA实验中，血清标本中血红蛋白与HRP反应显色出现假阳性结果；②冰冻保存血清样本须避免反复冻融：反复冻融标本所产生机械剪切力对蛋白等分子产生破坏作用，从而产生假阴性结果［1］；③待血液标本完全凝固方可加样，否则因反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留红细胞出现假阴性结果。
2.2 试剂准备 实验前将试剂从冰箱取出，室温放置20min以上以与室温平衡，使反应微孔内温度较快达到37℃，防止弱阳性样本出现假阴性。
2.3 加样与试剂 垂直加样（试剂）不可太快，以防止溅出和产生气泡，若加样过快，难以保证加样量的准确性。非垂直加样易加在微孔非包被区，致非特异性吸附。加样过猛易使样本（试剂）溅出对邻近孔产生污染，产生气泡使液面差异致酶标仪测定出现误差。为确保加入试剂的准确性，应使用精密移液器，不可使用滴瓶滴加。
2.4 孵育 孵育是决定ELISA测定成败关键环节，所需时间与温度成反比，最常用的孵育温度为37℃，30min。①反应时间：通常在加样（试剂）后，将微孔放入水浴箱时，孔内温度从室温升至37℃需一定时间，尤其在室温较低及非水浴状态下，升温时间会较长；如将微孔从放入水浴箱开始计时，使实际水育时间不够，导致弱阳性标本漏检。为保证设定温度下有足够孵育时间，可依据本实验室不同环境温度下微孔板从室温至孵育箱后达设定温度需要时间长短确定在孵育箱中孵育时间；②孵育温度：国产HIV抗体初筛ELISA试剂一般为37℃，30min；进口试剂可有37℃，1h；从抗原抗体反应本质来说，在较低温度下，反应较长时间最佳。在较高反应温度下，由于分子运动，反应时间缩短，对强阳性样本测定无影响，但对分子含量较少的弱阳性样本则有漏检可能；③“边缘效应”：产生边缘效应的原因可能与微孔板周孔与中心孔、孔周与孔中心表面热力学特征不同有关，研究证实热力学梯度是造成“边缘效应”的根本原因［2］。建议尽量使用水浴或将反应溶液与微孔板先加热至设定温度，即可避免“边缘效应”。
2.5 洗涤 ①固相免疫测定技术是一种非均相测定技术：需要洗涤将反应过程中非特异性吸附成份洗涤，以确认抗原抗体特异性结合；常用HIV抗体ELISA初筛试剂盒均以HRP(HRP)作为标记物的洗涤液，一般为含0.005g/L Tween20中性PBS，Tween20浓度不可过高，超过0.02g/L可使包被于固相上的抗原解吸附而影响实验测定下限；为防止洗板机洗涤后有液体残留，建议洗完后在吸水纸上拍干；②按要求次数洗涤。洗涤次数过少会因酶残留导致假阳性结果（花板）［3］，洗涤次数过多会导致假阴性结果。
2.6 显色 常用HIV抗体ELISA试剂盒多以HRP为标记酶，以四甲基邻苯胺（TMB）为底物。从理论上讲，在37℃，30min才可使底物催化完全，在最初10min内绝大部分催化反应即可完成。虽然试剂盒要求放置10min，为使弱阳性样本有充分显色，建议在37℃反应20-30min后终止反应进行测定为好。
2.7 双波长测定 ELISA测定中空白孔非特异性吸附具有不确定性，故测定时最好使用双波长。
2.8 空白设定 一般试剂盒均要求设空白，但我们在实际操作中发现，如使用双波长测定无需设空白，在使用单波长测定时可设空白，并不影响实验结果。如使用双波长测定并设空白可能会造成阴性孔吸光度值为负数现象，使结果判读难以解释。
【参考文献】
［1］赫启昌，贺霞，杜晓静，等。HIV抗体检测弱阳性结果分析［J］。中国公共卫生，2006，6：696。
［2］季阳，贾桂芹，张永刚。HIV抗体筛查与确证［J］。中国输血杂志，1994，4：179-181。
［3］于振喜，李连洁。用HIV法检测HIV抗体时如何避免“花板”？［J］。中国医药导报，2006，23：56。 |
