生物知识

抗生素治疗导致细菌内毒素释放的研究进展

作者:李晋 彭毅志 肖 来源:中华外科杂志 1998年第0期 发布时间: 2011-01-02 19:03  浏览次数:
购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于2001年的毕特博生物 www.bitebo.com
 

 


 

抗生素治疗导致细菌内毒素释放的研究进展

中华外科杂志 1998年第0期第36卷 综述

作者:李晋 彭毅志 肖光夏 吴其林

单位:610083 成都,成都军区总医院烧伤科(李晋、吴其林);重庆第三军医大学西南医院烧伤研究所(彭毅志、肖光夏)

  由革蓝阴性(Gˉ)细菌引起的各种感染仍是目前临床上主要的并发症和死亡原因之一。即使在应用各种广谱、高效抗生素治疗感染取得巨大进步的今天,对抗菌治疗中产生的一系列严重反应,如发热、中毒休克及多器官功能衰竭(MOF)等,仍然没有取得防治的根本性进展。其中抗生素治疗中导致G细菌释放内毒素(lipoplysaccharide,LPS),以及由其引起的严重损害存在着十分复杂的作用机理没有完全阐明,是一个主要原因[1]梅毒患者用汞剂治疗后可出现发热等症状加剧的反应,称为雅-赫二氏反应(Jarish-Herxheimer raction)。自五十年代以来,在抗生素治疗的患者中,因Gˉ细菌裂解释放出大量LPS造成临床症状恶化的证据,先后在布鲁氏菌、脑膜炎双球菌和Gˉ细菌肠脓毒症的患者中得到证实。自那以后,大量的实验证实,抗生素治疗中可以引起Gˉ细菌LPS释放,作用于单核巨噬细胞介导多种炎症因子释放,如:TNF-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、前列腺素、凝血素、干扰素、血小板基激活因子等。这些因子适量时可激活免疫系统,产生杀灭微生物的有益作用。过量时可引起机体严重病理生理反应,表现为发热、低血压、心动过速、休克、MOF及死亡[6,7]医学抗生素分册,1996,17:192-195.

  一、LPS及其作用原理

  1.LPS结构特点:LPS为Gˉ细菌外膜中的脂多糖成分。它由三部分组成:(1)O-特异性侧链;(2)核心多糖;(3)类脂A。O-特异链由20~40个重复单位组成,每个重复单位由3~7个糖分子组成。它是细菌表面的主要抗原,决定型的特异性。核心多糖可分为连接O-特异链的外核部分和连接类脂A的内核部分。核心多糖相对稳定,同一菌属结构相同。内核部分含有庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)两种特殊的糖类分子。它们在LPS结构中起着连结多糖与类脂的作用。类脂A由2个葡萄糖脂、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成,为LPS分子中最稳定的部分;各类Gˉ细菌均相同,它是LPS的主要毒性成分。目前认为在LPS中只有类脂A和KDO具有毒性。LPS的共同抗原在类脂A/KDO区,常被O-特异链遮盖而处于隐蔽状态[2,3]

  2.LPS与结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)、糖蛋白CD14:LBS为血清中一种糖蛋白,分子量为60000U,在肝细胞合成。LBP对各类细菌的类脂A均具有高度亲和力,能与LPS结合形成LPS-LBP复合物,促进LPS与单核巨噬细胞上的CD14结合。正常情况下含量较低,在应激状态下其含量可明显增加。CD14是一种分子量为55000 U的糖蛋白,借助磷酸酰肌醇聚糖锚吸附于单核巨噬细胞膜表面,为LPS-LBP复合物的受体。当LPS-LBP复合物与CD14结合后,激活有关酶系统,促进单核巨噬细胞合成、分泌多种细胞因子,如:TNF-α、IL-1、IL-6等,TNF-α被公认为引起内毒素休克、MOF等炎症反应的主要因子。目前认为LPS的毒性作用,主要是通过LBP和CD14这一途径实现的。因为LPS-LBP复合物诱导巨噬细胞产生TNF-α的能力是单一LPS的1000倍[4,5]

  3.LPS释放与炎症反应:早在一个世纪前,Jarish和Herxheimer就发现

  二、不同种类抗生素影响Gˉ细菌LPS释放的主要机理

  1.抑制蛋白质合成类抗生素与LPS释放:氨基糖甙类、氯霉素类和喹诺酮类抗生素能够抑制细菌蛋白质的合成,导致生长停止、增殖减慢而死亡。因而这类抗生素在多数实验中显示了释放LPS缓慢,释放量较其它种类抗生素低的特性。环丙沙星由于能引起细菌丝状改变,仍可导致LPS的大量释放。另外一些研究发现,G菌的外膜表面存在钙、镁阳离子。正常情况下它们起连接LPS与磷脂分子的桥梁作用,能稳定LPS分子。当去除这些离子后,LPS会变得不稳定而释放出来。庆大霉素和环丙沙星可与钙离子络合,引起LPS释放。这种作用能被过量的镁离子所抑制。使细胞成分改变,造成膜的损伤,也是氨基糖甙类抗生素的作用机制之一。一些研究者认为,氯霉素引起的脑膜炎双球菌释放LPS,也是由于细胞膜的损伤,造成膜成分改变,使细菌细胞壁丧失了LPS的结合力所致。环丙沙星引起的细菌丝状改变的机理不明[8~10]

  2.干扰细胞膜通透性类抗生素与LPS释放:Gˉ细菌细胞壁较薄而疏松,粘肽只占细胞壁的10%~20%。而含有大量的LPS、脂蛋白和双层磷脂的外膜,其内侧为含类脂质的胞浆膜。多粘菌素B等多肽类抗生素由肽键连接的环状高分子化合物组成,结构中有游离的-NH2和-COOH。带正电的-NH2与Gˉ细菌胞膜中磷脂上带负电的PO4-3结合,改变了细胞膜的通透性,使菌体内的氨基酸、核酸、K+等成分外漏而死亡。LPS中的类脂A也含有PO4-3,故认为多肽类抗生素具有中和LPS的能力。许多实验已证实多粘菌素B作用于Gˉ细菌后,仅引起低而缓和的LPS释放。细菌释放出的LPS激活单核巨噬细胞释放TNF-α,这一作用可被多粘菌素B抑制。如在用B型嗜血流感杆菌为模型的动物实验中,单用头孢他啶治疗时,血中的TNF-α显著增加,加用多粘菌素B后便抑制了约98%的TNF-α释放。表明多粘菌素B能够中和及减少Gˉ细菌释放LPS,因而阻断了由其引起的TNF-α释放。最近发现氨基糖甙类也能结合LPS,但作用明显不如多粘菌素B[11,12]

  3.青霉素结合蛋白与LPS释放:传统理论认为,β-内酰胺类抗生素的主要杀菌机制是抑制细菌细胞壁的合成。因为这类抗生素都含有一个β-内酰胺环,与细菌N-乙酰胞壁酸五肽的最后二肽,即D-丙氨酰酸相似,能竟争结合转肽酶,形成青霉噻唑酶,使其失活,转肽过程中止,使细菌细胞渗透压增高裂解而死亡。青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)是细菌胞浆膜上的一种微小蛋白质,分子量在30000~150000 U之间。各种细菌PBPs谱不同,约3~10种,主要有6种,按分子量由大到小排序为:PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6。有的还有亚型:如PBP1a、PBP1b、PBP1c等。通过对底物分析,PBP1~3与肽多糖转肽酶和葡萄糖转移酶活性有关;PBP4~6与羧肽酶活性有关。现已明确,PBPs实际上是有关粘肽合成的一类催化酶-青霉素敏感酶(penicillin sensitive enzymes)。PBPs数量极少,仅占细胞膜蛋白总量的1%,每个细胞只有20~30个分子。个别的PBPs性质已比较清楚,如PBP5为一种D,D-羧肽酶,分子量50000 U。通过一较短亲水肽(20~30个氨基酸)的羧基端嵌入在胞浆膜上,其氨基端和活性部位向外。每一种PBPs与β-内酰胺抗生素作用的详细机制仍不清楚。目前比较重视的是PBP1~3。因为PBP1与细胞快速裂解有关;PBP2和PBP3与细菌形态改变有关,这些都与LPS释放有关[13]

  不同的抗生素对不同的PBPs的亲和力不同,同种抗生素在不同的浓度下对PBPs的结合类型也不同。如:伊米配能在1~2倍MIC(最低抑菌浓度)时,优先与PBP2结合,使细菌成为渗透压稳定的大球形细胞,没有裂解;浓度大于5倍MIC时,与PBP1亲和力增加,导致迅速裂解。头孢他啶在低浓度时优先与PBP3结合,使细菌变成丝状;高浓度时也与PBP1结合,使细菌迅速裂解。初步认为其作用机理是,PBP1能控制细菌生长和菌体增大,是细菌生长的重要蛋白,主要功能为维持细胞形态,与抗生素结合可致细菌迅速裂解。PBP3能使细菌分裂停止,但不影响生长,故使细菌变成细长的丝状,其长度可达原体积的30倍。PBP2的作用机理尚不清楚,可能与维持细胞有关。在一项以头孢他啶(与PBP3结合)和伊米配能(与PBP2结合)的体外实验表明,头孢他啶引起的LPS释放量大于伊米配能10倍。对于这种现象,目前认为与PBP3的结合使细菌发生丝状变,生长没有停止,随着菌体的伸长LPS含量也不断增加,当PBP1受抑止致细菌裂解时,便释放出大量的LPS,其量明显高于与PBP2结合的伊米配能引起的球形变(因生长停止)。兼有上述两种变化的抗生素已在实验室中观察到,如美洛配能(meropenem)在浓度≤MIC时,与PBP3结合,引起丝状变,释放较多LPS,与头孢他啶相似;在浓度>2倍MIC时,与PBP2结合,出现球形变,释放较少LPS,与伊米配能相似。但多数实验表明,美洛配能主要与PBP3结合。同时也证明,伊米配能引起的LPS释放及由此引起的TNF-α、IL-6等介质释放量均低于优先与PBP3结合的抗生素,如:头孢他啶、美洛配能、头孢三嗪等[14~17]

  三、LPS血症防治研究进展

  抗生素的治疗,虽然能有效杀灭入侵的病原体,但随之而来的大量LPS释放给许多严重感染性疾病的救治,造成了极大困难,目前临床上尚缺乏有效地防治办法。尽管近年来已发现了许多新的拮抗剂,但多数仍停留在探索阶段。另外,随着对抗生素作用机制认识的加深,已经发现一些抗生素具有中和或减少LPS释放的能力。

  1.免疫治疗:(1)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb):这类抗体种类较多,主要为IgM和IgG两种,分别针对O-特异链、核心多糖和类脂A发挥作用。如:HA-1A、E5、McAb5B10、McAb8G9、McAb1B6、McAb3D10等。其中,较早应用于临床的HA-1A由于疗效差,存在严重不良副作用,因而已停用。E5(抗类脂A IgM抗体)临床应用显示了良好效果,能降低LPS和TNF-α,提高生存率。但对细胞结合型LPS无效。这是因为疏水的类脂A位于深部,受O-特异链遮蔽。但McAb1B6(Ig2A)能结合深部的类脂A。这些抗体通过中和LPS、促进单核细胞吞噬LPS及内在化作用发挥了良好的抗LPS作用。但这些抗体只能早期应用,过晚由于TNF-α已被激活释放,因而不能改善LPS引起的炎症反应[18]。(2)联合免疫:由于单克隆抗体仅针对LPS,不能对已产生的细胞因子起作用。因而采用多种McAb联合应用,比单一McAb更有效。Cross等[19]进行了由O-特异链McAb、J5多克隆抗血清和抗TNF-αMcAb组成的三联免疫动物实验。在没有用抗生素的情况下,单用任何一种制剂的生存率为25%~43%;任何2种制剂联合应用的生存率为50%~60%;3种制剂联合应用的生存率为77%。

  2.重组LPS中和蛋白:重组LPS中和蛋白(recombinant endotoxin neutralizing protein,rENP)以鲎制取,对各种细菌的LPS均有高度亲和力。动物实验表明rENP能够显著降低抗生素治疗中的LPS和Gˉ细菌脓毒症的病死率,其疗效明显高于HA-1A[20]

  3.LPS拮抗剂:E5531为无毒性的红杆菌属外膜中的类脂A成分,已由实验室合成。E5531能竟争结合LPS受体,抑制LPS介导的细胞毒作用。动物实验表明,E5531与抗生素联合使用,能明显降低LPS的致死率[21]

  4.粒细胞抗菌蛋白:从多形核白细胞的嗜天青颗粒中,已分离出3种抗菌蛋白质:(1)杀菌性通透性增加蛋白(bactericidal permeability-increasing protein,BPI);(2)抗菌15 Ku蛋白(antibacterial 15000 U protein isoforms,P15s);(3)中性白细胞肽(nautrophil peptides,NPs)。BPI分子量55000 U,具有强大的杀菌、中和LPS和抑止TNF-α分泌的能力。P15s和NPs也具有一定的杀菌、中和LPS的能力,但对长链LPS(S型)无作用。3种蛋白经比较实验,证明它们的作用强度为:BPI远大于P15s,而后者与NPs相同。由于PBI的全部抗菌活性基团位于25000 u区域,因此已人工合成重组23000 U的BPI,即rBPI23。经临床实验证明,rBPI23能显著降低LPS、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平,减少了中性白细胞脱颗粒作用,因而抑制了LPS引起的生物效应。在4周的临床实验期中,任何受试者体内没有出现抗rBPI23抗体,肝、肾、骨髓功能无异常。除了部分受试者有短暂的皮肤潮红外,无其它任何副作用,应用前景十分良好[22]

  5.具有中和、减少LPS释放类抗生素:(1)多粘菌素B:由于其独特的化学结构,人们已发现多粘菌素B具有中和LPS的能力。许多实验已证明,该药单独或与其它抗生素联合应用,均能减少LPS的释放。但由于该药抗菌谱窄,有严重肾毒性副作用,因而限制了该药的应用范围。为此,人们已将多粘菌素B制成了复合制剂,如:多粘菌素B-右旋糖酐70、多粘菌素B-IgG等。该类复合制剂降低了肾毒性,仍保留了杀菌力和中和LPS的能力[23,24]。(2)新型β-内酰胺类抗生素许多体内外实验已经证实,凡与PBP2亲和力强的β-内酰胺类抗生素仅导致较低的LPS释放。已发现的这类抗生素有伊米配能、克拉维酸、氮卓脒青霉素、头孢诺米、头孢吡肟等。目前证明效果最好的是伊米配能。一项临床对照实验表明,LPS毒血症患者,经治疗4小时后,伊米配能(与PBP2结合)组的3例患者LPS水平已降低;头孢他啶(与PBP3结合)组的4例患者LPS水平没有降低,其中2例患者的LPS水平增加了。正在开发的新一代碳青霉烯类抗生素L-627(biapenem),不需与脱氢肽酶Ⅰ抑制剂联用,杀菌作用更强,副作用更轻,尤其对大肠杆菌PBP2、PBP4,绿脓杆菌PBP1a、PBP2、PBP4显示出强的亲和性。其特性明显优于第一代的伊米配能。而另2种已上市的碳青霉烯类抗生素美洛配能和帕尼配能(penipenem),主要与PBP3结合,无降低LPS的作用。选用优先与PBP2结合的抗生素,既能杀菌,又能减少LPS的释放,可以提高严重感染性疾病的救治水平[14,16,17,25,26]

参考文献

  1 Holzheimer RG. The significance of endotoxin release in experimental and clinical sepsis in surgical patients-evidene for antibiotic-induced endotoxin reliease ? Infection,1998, 26:77-84.

  2 Bayston KF, Cohen J. Bacterial endotoxin and current concepts in the diagnosis and treatment of endotoxamia. J Med Microbiol, 1990,31:73-83.

  3 Mitov IG, Terziiski DG. Immunoprophyiaxis and immunotherapy of gram-negative sepsis and shock with antibodies to core glycolipids and lipid A of bacterial lipopolysaccha rides. Infection, 1991, 19:383-390.

  4 Haziot A, Chen S, Ferrero E, et al. The monocyte differentiation antigen, CD14, is anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol linkage. J Immunol ,1988,141:547-552.

  5 Sherry B, Cermi A. Cachectin/tumor necrosis factor exerts endocrine, paracrine, and autocrine control of inflammatory responses. J Cell Biol, 1988,107: 1269-1277.

  6 Norimatsu M, Morrison DC. Correlation of antibiotic-induced endotoxin release and cytokine production in Escherichia coli-inoculated mouse whole blood ex vivo. J Infect Dis, 1998,177:1302-1307.

  7 Bucklin SE, Morrison DC.Differences in therapeutic efficacy among cell wall-active antibiotics in a mouse model of gram-negative sepsis. J Infect Dis,1995, 172:1519-1527.

  8 Jackson JJ, Kroop H. Beta-lactam antibiotic-induced release of free endotoxin in vitro conparison of penicillin-biding protein (PBP) 2-specific imipenem and PBP-specific ceftazidim. J Infect Dis, 1992, 165:1033-1041.

  9 Nitsche D, Schulze C, Oesser S, et al. Impact of different classes antimicrobial agents on plasma endotoxin activity. Arch Surg, 1996,131:192-199.

  10 Trautmann M, Zick R, Rukavina T, et al. Antibiotic-induced release of endotoxin:in-vitro comparison of meropenem and other antibiotics. J Antimicrob Chemother, 1998,41:163-169.

  11 Evans ME, Pollack M. Effect of antibiotic class and concentration on the release of lipopolysaccharide from Escherichia coli. J Infect Dis, 1993, 167:1336-1343.

  12 Jaber BL,Barrett TW, Cendoroglo-Neto M, et al. Endotoxin removal by polymyxin-B immobilized polystyrene-derivative fibers during in vitro hemoperfusion of 10% human plasma. ASIO, 1998,44:54-61.

  13 周坚芬.青霉素结合蛋白研究进展.国外

  14 Prins JM, Agtmael MA, Kuijper EJ, et al. Antibiotic-induced endotoxin release in patients with gram-negative urosepsis: a duoble-blind study comparing imipenem and ceftazidim. J Infect Dis, 1995, 172:886-891.

  15 Lundblad R,Giercksty KE.Synergistic effect of E5,imipenem and volume support during fulminant intraabdominal sepsis in rats.J Infect Dis,1995,172:152-160.

  16 Takahashi K, Narita K, Kato Y , et al. Low-level release of Shiga-like toxin (vero-cytotoxin) and endotoxin from enterohemorrhagic Escherichia coli treated with imipenem. Antimicrob Agents Chemother, 1997 ,41:2295-2296.

  17 Arditi M, Zhou J. Differential antibiotic-induced endotoxin release and interleukin-6 production by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) : amplification of the response by coincubation of HUVECs and blood cells . J Infect Dis,1997,175:1255-1258.

  18 Hoffman WD, Pollack M, Banks SM, et al. Distinct functional activities in canine septic shock of monoclonal antibodies specific for the O-polysaccharide and core regions of escherichia coli lipopolysaccharide . J Infect Dis,1994,169:533-561.

  19 Cross AS, Opal SM, Palardy JE, et al. The efficacy of comination immunotherapy in experimental pseudomonas sepsis. J Infect Dis,1993,167:112-118.

  20 Saladino RA, Stack AM , Thompson C, et al. High-dose recombinant endotoxin neutralizing protein improves survival in rabbits with Escherichia coli sepsis . Crit Care Med,1996,24:1203-1207.

  21 Christ WJ, Asano O, Robidoux AL,et al. E5531,a pure endotoxin antagonist of high potency . Science, 1995,268:80-83.

  22 Marijke AM, ronder MA, Kimmings N, et al. Inhibition of endotoxin-induced cytokine release and neurtrophil activation in humans by use of recombinant Bacterici/dal/Permeability-Increasing Protein. J Infect Dis, 1995,172:144-151.

  23 Bucklin SE, Lake P, Logdberg L, et al.Therapeutic efficacy of a polymyxin B-dextran 70 conjugate in experimental model of endotoxemia. Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1462-1466.

  24 Drabick JJ, Bhattacharjee AK, Hoover DL, et al. Covalent polymyxin B conjugate with human immunoglobulin G as an antiendotoxin reagent. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42:583-588.

  25 许铁男,编译.碳青霉烯类抗生素L-627.药学进展,1994,18:227-230.

  26 Chen HY, Livermore DM. In vitro activity of biapenem, compared with imipenem and meropenem, against pseudomonas aeruginosa strains and mutants with known resistance mechanisms. J Antimcro Chemother, 1994,33:949-958.

(收稿 :1998-02-25 修回:1998-09-16)

 

 

购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于2001年的毕特博生物 www.bitebo.com

所有试剂均用于科研      北京毕特博生物技术有限责任公司 版权所有
服务热线:010-82015225/400-833-9299 | 传真:010-62015131 | E-mail:info@bitebo.com
京ICP备05028556号-1   京公网安备11010802008747