【摘要】 目的 对进行鲎试剂检测法实验，建立参麦注射液细菌内素检测法。方法 按2005年版《中国药典》所收载的细菌内毒素的检测方法，进行实验。用不同厂家的鲎试剂对不同批号的参麦注射液分别进行干扰实验，考察确立参麦注射液细菌内毒素检测法。结果 将参麦注射液稀释60倍以上可消除干扰作用，检测结果全部为阴性。结果准确可靠。结论 参麦注射液可以用鲎试剂检查法取代家兔热源检查法。
【关键词】 参麦注射液 细菌内毒素 鲎试剂
1 前言
参麦注射液为一种中药注射剂，其主要成分为中药红参与麦冬的有效成分提取物，具有益气固脱，养阴生津，生脉之药理作用，临床上用于治疗气阴两虚型之休克，冠心病，病毒性心肌炎，慢性肺心病，粒细胞减少症等疾病.本实验通过实验探讨以鲎试剂法取代热原法检测参麦注射液中细菌内毒素的可行性。
细菌内毒素检测发(BET)法是利用鲎试剂来检测或量化革兰氏阴性菌产生的内毒素的一种方法。本方法包括两种检查方法，即凝胶法和光度测定法。本实验所采用的为凝胶法，是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反映的机理，检测供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。该方法较热原检测法灵敏，准确，快速和经济。美国药典(USP)，英国药(BP)，欧洲药典(EP)及日本抗生物质基准均收载了许多品种从热原检测法改为细菌内毒素检测法。[1]纵观各国动向以BET法取代热原法是大势所趋，同时也是反映检验水平提高及标准化的一个重要标志。
2 实验材料与方法
2.1材料
2.1.1鲎试剂（厦门鲎试剂实验厂，批号：20070131灵敏度λ=1.0EU/ml；批号：20080125，灵敏度λ=0.125EU/ml.）鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号20080307 灵敏度λ=0.125EU/ml）。
2.1.2细菌内毒素检测用水（鲎实验用水）（厦门鲎试剂实验厂 批号20080124；2ml/支）。
2.1.3细菌内毒素标准品（WSE）（中国生物制品检定所，批号20080321；10EU/支）。
2.1.4参麦注射液（四川川大华西药业公司，10ml/支，批号20080125；批号20080321）。参麦注射液（河北神威药业有限公司，10ml/支，批号20080521）。
2.1.5等渗氯化钠注射液（哈尔滨三联药业公司，250ml/瓶，批号20080120）。
2.1.6细菌内毒素检测用具（厦门鲎试剂实验厂）均干热灭菌一小时以上。
2.2方法
2.2.1鲎试剂的灵敏度的复核
按《中国药典》（2005版）附录之“细菌内毒素检测法”[2]项下所规定的“鲎试剂灵敏度复核试验”的内容操作。将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上，混匀15min，然后分别稀释成2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ（即1.0EU/ml，0.5EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml）四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步，均应在旋涡混合器上混匀30S，每一浓度平行做4支，同时用鲎实验用水做2支阴性对照管。根据公式λc=1g-1 (Σx/4)分别计算三个批号鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。式中X为待复核鲎试剂反应终点浓度的对数值(见表1)。λc均在0.5λ～2.0λ范围内(即0.25≤λ≤1.0)故此鲎试剂可用于细菌内毒素检查并以λ=0.5EU/ml作为三批鲎试剂的灵敏度。
2.2.2干扰预试验
2.2.3细菌内毒素限值(L)的确定[3]
参麦注射液临床每次最大用量为40 ml， 加入于250 ml等渗氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中，在一小时内滴注完毕.根据2005年版《中国药典》规定的药品细菌内毒素限值计算公式，L=K/M得出，M=40/（1*60）=0.67ml/(kg·h)(输液时间不足一小时按一小时计算，人均体重按60 kg计算。静脉注射计的致热阈值K为5EU/（kg·h）。因此细菌内毒素限值L=K/M=5/0.67=0.75 EU/（kg·h）
2.2.4稀释供试品[4-5]
计算参麦注射液有效倍数MVD，按公式：MVD=L/Lλ
当Lλ为1.0，0.5，0.25，0.125，0.063EU/ml时相应的MVD(λ=1.0)=7.5，MVD(λ=0.5)=15，MVD(λ=0.25)=30 ，MVD(λ=0.125)=60 ，MVD(λ=0.063)=120，用细菌内毒素检查用水把供试品吸释成以上五个浓度备用。
2.2.5稀释内毒素工作标准品
用上述不同浓度样品系列溶液将内毒素工作标准品稀释成2.0EU/ml的浓度备用。
2.2.6加样及反应
进行供试品阴性对照(NPC)和供试品阳性对照(PPC)两个系列的反应。NPC系列 取上述经灵敏度复核合格的鲎试剂(λ=1.0EU/ml)加细菌内毒素检查用水溶解，分别取0.1ml于8支反应管中再各加入上述稀释好的供试品0.1ml，每一供试品浓度，重复两反应管。PPC系列 取上述鲎试剂（λ=1.0EU/ml）加细菌内毒素检查用水溶解，分别取0.1ml于8支反应管中，再各加上述稀释好的2λ的内毒素工作标准品0.1ml，每一供试品浓度重复两反应管。将两系列的反应管置于（37±1）℃水浴中，保温(60±2)min，反应结果（见表2）
2.2.7干扰试验
根据干扰预试验结果，应选择供试品稀释倍数为60倍的进行干扰试验，即内毒素限值为0.125EU/ml。为考察对于λ=0.125EU/ml的不同厂家鲎试剂，样品在低于60倍稀释时是否也不存在干扰，用细菌内毒素检查用水将样品稀释30 倍及60倍后，分别进行干扰试验。干扰试验按《中国药典》2005年版细菌内毒素检查法的供试品干扰实验项进行，结果（见表3）。
药典规定当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）及Et在0.5Es～到2.0Es（包括0.5Es～2.0Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验没有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，在重复干扰试验。
实验结果显示，对于λ=0.125EU/ml的不同厂家鲎试剂，样品稀释30倍时，Es在0.5～2.0λ但Et不在0.5～2.0Es范围，存在干扰，而样品稀释60倍时Es在0.5～2.0λ且Et在0.5～2.0Es范围，故认为将供试品稀释60倍以上时对不同厂家，生产的鲎试剂不产生干扰。
2.2.8细菌内毒素检查法与热原检查法对比试验
2.2.9热原检查法
取上述三批参麦注射液按《中国药典》2005年版附录“热原检查法”检查。三批供试品检查结果均为阴性。（见表4）
2.2.10细菌内毒素检查法
取上述参麦注射液体（每批各取5支）分别用细菌内毒素检查用水稀释60倍，使用灵敏度λ为0.125EU/ml的鲎试剂按《中国药典》2005年版附录之“细菌内毒素检查方法”检查。结果全部呈阴性。
3 结果与讨论
3.1上述试验结果见下列各表：
表1 TAL灵敏度复核实验
TAL 内毒素浓度（EU/ml） 阴性对照 Λc(EU/ml)
1 0.5 0.25 0.125
20080301 ++++ ++++ ---- ---- -- 0.50
20080125 ++++ ++++ +--- ---- -- 0.42
20080307 ++++ ++++ ---- ---- -- 0.50
表2 参麦注射液干扰预试验
供试品稀释倍数 7.5 15 30 60
NPC系列 -- -- -- --
PPC系列 -- -- -- ＋＋
表3 参麦注射液干扰实验结果
样品稀 鲎试剂厂家 样品批号 内毒素浓度(EU·ml-1) 阴性 结果
释倍数 0.25 0.125 0.06 0.03 对照
30 厦门鲎试剂试试验厂 检查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.125
川大华西药业 20080125 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
河北神威药业 20080321 +++- ---- ---- ---- -- Et=0.297
河北神威药业 20080521 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
湛江安度斯公司 检查用水 ++++ ---- ---- ---- -- Es=0.149
川大华西药业 20080125 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.297
河北神威药业 20080321 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.353
河北神威药业 20080521 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
60 厦门鲎试剂试验厂 检查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.125
川大华西药业 20080125 ++++ ++++ ---- ---- -- Et=0.149
河北神威药业 20080321 ++++ ++++ -+-- ---- -- Et=0.104
河北神威药业 20080521 ++++ ++++ ++-- ---- -- Et=0.089
湛江安度斯生物有限公司 检查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.149
川大华西药业 20080125 ++++ ++++ -+-- ---- -- Et=0.104
河北神威药业 20080321 ++++ ++++ ---- ---- -- Et=0.149
河北神威药业 20080521 ++++ ++++ +--- ---- -- Et=0.104
表4 热源实验结果
生产厂家 供试品批号 检查结果
四川川大华西药业公司 20080125 （―）
四川川大华西药业公司 20080321 （―）
河北神威药业公司 20080521 （―）
3.2讨论
3.2.1注射剂质量控制中，采用家兔法检验细菌内毒素。由于操作复杂。影响因素多，而且费时。采用鲎试验法，操作简单迅速，且灵敏度高。
3.2.2 BET法检查细菌内毒素的反应机制如下：内毒素在钙，镁二价阳离子的参与下，首先激活TAL凝固酶系统的C因子，最后将凝固蛋白原变成凝固蛋白。除与内毒素反应外，TAL与β—葡聚糖反应造成假阳性，所以对一个新品种进行BET法的可行性探讨中，最突出的即为干扰实验，当药品中存在干扰因素时，均可导致结果异常，干扰实验就是确定供试品在什么范围内进行细菌内毒素检查，既可克服干扰因素，又能客观的反映出供试品所含内毒素是否符合规定限值，为了排除干扰，通常采用稀释法。如果样品在高浓度时对细菌内毒素无干扰，则在更低浓度时也不会产生干扰。
3.2.3初筛试验只是一种预试验，最终要经干扰试验验证，其目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质，以便初步筛选出对检查无干扰的样品浓度范围，及相应的鲎试剂灵敏度，从而为干扰试验提供必要的参数，避免鲎试剂的浪费。从表3结果可看出，样品对细菌内毒素检查的干扰性质为抑制作用，样品对鲎试剂无干扰的有效稀释倍数为60倍。在此有效浓度以下可以选择灵敏度为0.125EU/ml以上的鲎试剂对相应的样品稀释浓度做干扰试验。
由干扰试验结果可看出，三批样品分别使用不同厂家生产的鲎试剂，将样品稀释60倍，其Es在0.5λ～2.0λ且Et在0.5Es～2.0Es.按2005年版本《中国药典》干扰试验的判断方法，可以认为样品在该浓度下不干扰细菌内毒素的检查，因此将样品稀释60倍进行细菌内毒素的检查是可行的。
参 考 文 献
[1] 李勇军，胡昌勤，金少鸿.四国药典抗生素品种细菌内毒素限值的比较.中国药事，2000，14（2）：110.
[2] 中国药典.2005年版，附录XI,E,85.
[3] 黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计. 药学杂志.1997，32（2）：72.
[4] 苑庆华，唐元泰，赵海山等.右旋糖酐20葡萄糖注射液细菌内毒素检测.药物分析杂志.2001，21（4）：293.
[5] 施震，尹银嘉，李华.注射用头孢替唑中细菌内毒素的检测.中国药学杂志.2003，38（5）：377.
www.chinaqking.com 期刊门户-中国期刊网 来源:《中外健康文摘》2009年第16期供稿文/隋秋林 (哈尔滨市第四医院 黑龙江哈尔滨 150026）
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