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问题
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可能原因
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解决方法
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无颜色
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试剂孵育的时间没有按说明书操作。
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确定生物素化抗体，联接的hrp试剂或链霉亲和素-hrp使用的时间是否适当。
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不同试剂盒或不同批号的试剂混用。
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重新检查试剂的标签，确保所有组分都属于正使用的试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
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漏加酶
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检查操作流程，注意不要漏加
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hrp酶污染了叠氮钠
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使用新配制的试剂，禁含叠氮钠
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标准品有问题（若在标本孔中有信号）
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按说明书检查标准品的配制过程
使用1瓶新标准品
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某一容器未洗净,残留灭活酶物质
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尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠
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使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体
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重新确认所选用的试剂
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.漏加显色剂a或b
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加显色剂后观察孔中液面高度
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试剂配制/使用有误
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将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。
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缓冲液污染
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配制新鲜的缓冲液
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显色弱
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超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。
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检查产品的有效期
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加入试剂的体积和时间有误
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确定所使用的每一个试剂的体积正确和加入时间是适当。
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试剂、样品用前未能平衡
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用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右
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缩短孵育时间能使实验的信号变弱。
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检查孵育的时间。
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在温度变化的环境内孵育酶标板。
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确定孵育的温度，应避免温度的变化。
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使用了被污染的试剂
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检查试剂是否被污染。
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标准品/标本制备方法不规范
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检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用nan3防腐,抑制了酶的反应
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显色底物制备不规范
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检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。
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检测时间不当
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是否在规定的时间内检测。
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仪器设定不正确，滤光片不匹配。
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仪器是否设定正确，滤光片的选择是否相符等。
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高背景（本底）
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洗涤操作不规范
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洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。
检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。
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实验中孵育温度和时间不适当
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确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当
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酶加量过多
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加酶前验看移液器调节量是否准确。
检查稀释度，必要时需做效价测定试验。
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封闭不完全
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检查封闭液的计算量；延长封闭时间。
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标本或标准品中的干扰物质
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做适当的对照
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显色剂受光照时间较长,或污染
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显色剂a和b应于使用前10分钟从冰箱取出
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整批样品放置时间过长,样品污染
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样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染
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缓冲液污染
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制备新鲜的缓冲液
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吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂
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吸头尽可能一次性使用
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太多的信号：
全部的板子变成规则的蓝色
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不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。
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最好使用洗板机充分洗涤
检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。
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底物溶液混合太早并转成蓝色
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应控制底物混合的时机并立即使用
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太多的酶结合物
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检查稀释度，必要时进行效价测定
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封板膜或试剂容器被重复使用，导致hrp残留，使tmb底物产生非特异蓝色。
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使用新的封板膜，每步使用不同的试剂容器
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缓冲液中污染金属或hrp
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制备新鲜缓冲液
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高cv值（cv：coefficient of variation），花板
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操作不慎或洗涤不充分
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按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述
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出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用
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确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。
使用封板膜封口，注意每步使用新的封板膜。
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由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。
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稀释用的pbs中不要加其它蛋白
检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。
检查所使用的酶标板，使用elisa板（不要使用组织培养板）
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移液器不准确，吸头重复使用。
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检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。
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样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分
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标本充分离心, 3000rpm 6分钟以上，严禁使用凝血（溶血）的标本
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缓冲液污染
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制备新鲜的缓冲液
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标准曲线可得到，但两点之间区别很差（低或平的曲线）
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酶结合物不足
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检查稀释度，必要时进行效价测定
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捕获抗体没有很好结合到板上
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检查所使用的酶标板，使用elisa板（不要使用组织培养板）
稀释用的pbs中不要加其它蛋白
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检测抗体不足
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检查稀释度，必要时进行效价测定
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板子显色不足
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延长底物孵育实验
使用推荐品牌的底物溶液
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操作不慎
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回顾elisa操作流程，消除任何擅自修改的程序。
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标准曲线稀释度计算有误
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核查计算的情况，制备新的标准曲线
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标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生
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在标本中无相应的细胞因子
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使用内参对照
重复实验，重新考虑实验的相应参数
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标本基质遮盖检测
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将标本至少做1∶2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性
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标准曲线很好，但是标本的判读值很高
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标本中含的细胞因子水平超过检测范围
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将标本做稀释并再次实验
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当使用hrp酶结合物时，tmb底物加终止液后显绿色
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孔中的试剂显色不充分
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轻轻振荡板子
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边缘效应
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工作环境温度不均衡
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避免将酶标板在变化温度环境中孵育
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漂移
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实验过程中出现间断
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整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备
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试剂没有按说明书平衡至室温
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在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。
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是否可更改试剂盒 所提供的实验操
作步骤？
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一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。
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是否可混用不同试剂盒中的试剂？
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不允许。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商联系。
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是否可增加或减少标本的体积。
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商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。
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是否可重确定自己的标准曲线的点？
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可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在检测范围内，高于试剂盒中最高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。
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